Quirion, B., Bergeron, F., Blais, V., & Gendron, L. (2020). The delta-opioid receptor; a target for the treatment of pain. Frontiers in Molecular Neuroscience, 13, 52.
Introduction
De nos jours, la douleur représente l’un des fardeaux sociétaux les plus importants. Les traitements actuels sont cependant trop souvent inefficaces et/ou accompagnés d’effets indésirables débilitants pour les patients souffrant de douleurs chroniques. En effet, l’opioïde prototype qu’est la morphine, comme beaucoup d’autres analgésiques puissants, présente des effets indésirables néfastes tels que la dépression respiratoire et la constipation, et entraîne également une tolérance, une dépendance physique et une addiction. L’urgence de développer de nouveaux traitements contre la douleur tout en minimisant les effets indésirables est donc cruciale. Au fil des années, le récepteur delta-opioïde (DOP) est apparu comme une cible prometteuse pour le développement de nouvelles thérapies contre la douleur. En effet, cibler le DOP pour traiter la douleur chronique représente une alternative opportune aux médicaments existants, étant donné le faible spectre d’effets indésirables des agonistes du DOP. Nous passons ici en revue les connaissances actuelles soutenant un rôle pour la DOP et ses agonistes dans le traitement de la douleur. Plus précisément, nous nous concentrerons sur la localisation cellulaire et subcellulaire de la DOP dans le système nerveux. Nous discuterons également plus en détail des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le contrôle du trafic cellulaire de la DOP, connu pour différer significativement de la plupart des récepteurs couplés à la protéine G. Cet article de synthèse permettra de mieux comprendre comment le DOP représente une cible prometteuse pour développer de nouveaux traitements pour la gestion de la douleur, et où nous en sommes quant à notre capacité à contrôler son trafic cellulaire et son expression à la surface des cellules.
Affectant plus d’un tiers de la population nord-américaine au cours de sa vie, la douleur chronique est plus fréquente que les maladies cardiovasculaires, le diabète et le cancer réunis. Selon l’enquête 2010 du Medical Expenditure Panel Survey (MEPS), la douleur chronique est l’un des fardeaux socio-économiques les plus importants aux États-Unis, avec des coûts annuels estimés entre 560 et 635 milliards de dollars ; 261 à 300 milliards de dollars en coûts directs de soins de santé et 299 à 335 milliards de dollars en perte de productivité et autres coûts indirects. Avec le vieillissement de la population, on prévoit que ces chiffres doubleront au cours de la prochaine décennie. Malgré des effets indésirables notoires et un manque d’efficacité dans de nombreux types de douleur, les opioïdes restent la norme de soins pour traiter les affections modérées à sévères. L’utilisation des opioïdes a conduit à leur détournement et à leur mauvaise utilisation généralisés appelant le Département américain de la santé et des services sociaux (HHS) à déclarer une crise des opioïdes en 2017. De concert avec les sociétés pharmaceutiques et les centres de recherche universitaires, trois objectifs principaux ont été élaborés : (1) concevoir des stratégies sûres, efficaces et non addictives pour gérer la douleur chronique ; (2) de nouveaux médicaments et technologies innovants pour traiter les troubles de l’utilisation des opioïdes ; et (3) améliorer les interventions de prévention et d’inversion des surdoses pour sauver des vies et favoriser le rétablissement2.
Les opioïdes agissent via les récepteurs opioïdes, à savoir Mu (μ), Kappa (κ) et Delta (δ). Les opioïdes les plus prescrits (par exemple, la morphine, le Fentanyl, la codéine) ciblent préférentiellement les récepteurs opioïdes μ (MOP). Ces substances, qui comptent parmi les analgésiques les plus puissants, produisent des effets divers et sont responsables de presque tous les effets indésirables prototypiques des opioïdes, tels que l’euphorie, l’obscurcissement mental, la sédation, la dépression respiratoire et la suppression de la toux, le myosis pupillaire (stimulation parasympathique du nerf oculomoteur), l’antidiurèse, la rétention urinaire, les nausées et les vomissements, la bradycardie et la vasodilatation, la constipation et la rétention biliaire, ainsi que la libération d’histamine.
L’activation sélective du récepteur δ opioïde (DOP) a un grand potentiel pour le traitement de la douleur chronique avec des effets annexes de type anxiolytique et antidépresseur. Leur capacité à provoquer des réponses émotionnelles est hautement souhaitable en raison de l’association fréquente de l’anxiété et des troubles de l’humeur avec la douleur chronique. Par rapport aux agonistes de la MOP, les molécules agissant sur la DOP présentent généralement des effets indésirables réduits. Nous passons ici en revue les découvertes importantes qui soutiennent le rôle de la DOP dans le traitement de la douleur chronique. Comme ses rôles physiologiques sont directement liés à son expression cellulaire et subcellulaire, nous discutons également de la distribution de la DOP le long des voies de la douleur ainsi que des mécanismes cellulaires qui régulent son trafic vers la surface cellulaire.
Voies ascendantes et descendantes de la douleur
Le traitement de la douleur passe par une voie neurologique distincte. La propagation de la douleur commence par l’activation de récepteurs, appelés nocicepteurs, qui sont largement présents dans les tissus périphériques, les muscles et les organes. Les fibres sensorielles nociceptives transforment les stimuli et génèrent un potentiel de membrane qui, si le seuil est atteint, génère une impulsion. L’initiation ou non du potentiel d’action dépend de l’intensité du stimulus. Les nocicepteurs ont un seuil élevé par rapport aux autres récepteurs et seul un stimulus fort, potentiellement dangereux, les active. L’impulsion se propage le long de la fibre afférente primaire pour atteindre le système nerveux central. Les fibres afférentes primaires sont des neurones pseudo-unipolaires, ce qui signifie que leur corps cellulaire possède un axone émergent qui se divise en projections périphériques et centrales. La branche périphérique innerve l’organe cible (peau, muscle, viscères) tandis que l’axone central se projette vers la corne dorsale de la moelle épinière qui est organisée en lamines anatomiquement différentes. Les corps cellulaires des afférences primaires sont situés dans les ganglions de la racine dorsale (DRGs) et du trijumeau (TGs). Ces neurones sont communément classés en fonction de leur taille (neurones de petit, moyen et grand diamètre), de leur vitesse de conduction et de leur niveau de myélinisation. Il est intéressant de noter que les neurones DRG et TG ont des rôles variés en ce qui concerne la proprioception, l’extéroception et la nociception. Les fibres myélinisées (Aδ) de diamètre moyen et les fibres C non myélinisées de petit diamètre sont principalement responsables de la nociception. Les fibres Aα et Aβ sont également des fibres afférentes primaires respectivement impliquées dans la proprioception et le toucher, bien qu’elles puissent également être impliquées dans la nociception. Après l’intégration des stimuli nocifs au niveau de la moelle épinière, le signal nociceptif emprunte différentes voies ascendantes vers le thalamus et le tronc cérébral, à savoir les trajets spinothalamiques et spinoréticulothalamiques. Une fois que le signal atteint les structures corticales, il est traité au niveau des cortex sensoriel, cingulaire et insulaire. En plus des voies ascendantes de la douleur, un système d’inhibition endogène appelé circuit descendant de modulation de la douleur fait également partie des circuits de la douleur. Ce circuit implique de multiples régions du système nerveux central telles que le néocortex frontal, l’hypothalamus, l’amygdale, le cortex cingulaire antérieur rostral (rAAC), la région grise périaqueducale (PAG), la médulla et la médulla rostroventrale (RVM). Cet ensemble se projette vers la corne dorsale de la moelle épinière pour moduler le signal ascendant de la douleur. Pour soulager la douleur, un médicament doit donc agir sur une cible exprimée au moins dans l’une de ces structures.
Distribution des récepteurs delta-opioïdes dans le système nerveux central
A ce jour, la distribution cellulaire du DOP le long des voies de la douleur reste peu claire. Selon la technique utilisée pour évaluer l’expression du DOP dans les tissus, des différences significatives sont observées concernant sa localisation. Des approches telles que l’hybridation in situ, l’immunohistochimie, l’autoradiographie à l’aide de ligands radiomarqués, le test GTPγS et les modèles de souris génétiquement modifiées ont été utilisées pour étudier la distribution de la DOP. Les petites divergences dans la distribution du récepteur entre les études peuvent être attribuées à des différences dans le traitement des tissus, l’utilisation de différentes espèces, et/ou la sensibilité du ligand. Cependant, l’une des plus importantes controverses dans le domaine provient d’une comparaison de la distribution du récepteur en utilisant des anticorps dirigés contre la DOP et l’utilisation de souris transgéniques knockin DOP-eGFP (DOP-eGFP KI). La distribution de la DOP à l’aide de ces deux techniques est sensiblement différente et certaines préoccupations se posent pour chacune d’entre elles. Il est vrai que la plupart des anticorps dirigés contre la DOP manquent de spécificité, car de nombreux anticorps disponibles dans le commerce et personnalisés colorent la moelle épinière des souris DOP-KO de la même manière que celle des souris de type sauvage. Bien que l’utilisation de souris exprimant des récepteurs chimériques portant une protéine GFP de 23 kDa dans leurs boucles intracellulaires ou leur queue C-terminale ne soit peut-être pas la meilleure approche pour visualiser la distribution endogène de la DOP, cet outil offre la possibilité de détecter directement le récepteur dans des tissus natifs ou fixés, parfois sans avoir besoin d’utiliser des anticorps. Cependant, l’utilisation de tels marqueurs intracellulaires (comme la GFP) est sujette à débat. En effet, la distribution et la compartimentation cellulaires du DOP et d’autres RCPG sont modifiées par l’ajout d’une étiquette eGFP. En résumé, chaque technique a ses forces et ses faiblesses pour identifier le DOP dans les tissus.
Expression du DOP dans le cerveau
Le récepteur delta-opioïde (DOP) est largement distribué dans le cerveau, sans différence significative entre les rongeurs et les humains. Le long des voies de la douleur, le DOP est exprimé dans les structures des voies ascendantes et descendantes de la douleur. Plus précisément, la DOP est présente dans le PAG, le RVM, le cortex cérébral et l’amygdale. Plus intéressant encore, il est probable que la DOP ne participe pas seulement au contrôle de la douleur mais aussi des troubles de l’humeur tels que l’anxiété et la dépression.
Expression de la DOP dans la moelle épinière
Dans la moelle épinière des rongeurs, l’expression de DOP est prédominante dans les lamines superficielles I et II. L’expression s’étend également à d’autres lamines, y compris une large distribution dans toute la matière grise et les motoneurones situés dans les cornes ventrales. Diverses techniques, dont l’immunohistochimie, l’autoradiographie à l’aide de radioligands sélectifs de la DOP, l’hybridation in situ et les souris transgéniques confirment cette large distribution de la DOP. L’étude de la distribution cellulaire de la DOP chez les souris DOP-eGFP KI a révélé que la plupart des neurones positifs à la DOP situés dans la lamina II expriment TLX3, un marqueur des interneurones excitateurs spinaux. La présence de DOP dans ces neurones est étayée par des études électrophysiologiques où le potentiel membranaire de repos et les schémas de tir du potentiel d’action ont été mesurés. Ces neurones sont maintenant connus pour être des neurones positifs à la somatostatine probablement impliqués dans la transmission de stimuli mécaniques nocifs.
Chez les espèces supérieures, la distribution de la DOP dans la moelle épinière semble légèrement différente. Chez le singe, la fixation du radioligand a révélé que la DOP est exprimée à un niveau plus élevé dans les lamines superficielles plutôt que dans les lamines plus profondes, avec une forte densité de marquage de la DOP dans la lamina II. Plus intéressant encore, les sites de liaison de la DOP dans la moelle épinière humaine sont encore plus limités aux lamines superficielles, sans marquage apparent dans les lamines III-X. Une expression plus restreinte de la DOP dans la moelle épinière humaine fait appel au rôle de la DOP dans la régulation de l’activité des afférences primaires. L’absence apparente d’ARNm de la DOP dans la moelle épinière humaine suggère que le récepteur est présent sur les terminaisons synaptiques des afférences primaires se projetant vers les lamines I et II alors que, chez les rongeurs et les singes, l’hybridation in situ a montré une distribution étendue de l’ARNm de la DOP dans toute la matière grise. L’ARNm de la DOP est également exprimé dans les motoneurones de la corne ventrale de la moelle épinière de la souris, du rat et du singe, mais pas chez l’homme. En résumé, le profil d’expression de l’ARNm et de la protéine DOP dans la moelle épinière humaine, mais aussi d’autres espèces, soutient un rôle de la DOP dans le contrôle de la douleur. Dans toutes les espèces, mais plus particulièrement chez l’homme, la présence de DOP sur ce qui semble être les terminaisons afférentes primaires suggère que ce récepteur est synthétisé dans les afférences primaires et transporté vers la moelle épinière. Cette hypothèse est étayée par le fait que la désafférentation diminue significativement la densité de DOP dans la corne dorsale de la moelle épinière chez les rongeurs.
Expression de la DOP dans les afférences primaires
Comme mentionné ci-dessus, la DOP est exprimée dans les afférences primaires, la toute première étape des voies de traitement de la douleur. Les neurones somatosensoriels, plus précisément les neurones DRG, sont responsables de la détection et de la transmission des stimuli nocifs au cerveau. Dans les neurones DRG, les récepteurs opioïdes régulent l’excitabilité cellulaire et la libération de neurotransmetteurs. Cependant, la distribution exacte de la DOP dans ces neurones reste controversée.
Il existe deux opinions divergentes sur la distribution de la DOP dans les neurones somatosensoriels. La première école de pensée déduit que la DOP se trouve principalement dans les gros neurones myélinisés du DRG et rapporte un faible niveau de co-expression avec la MOP. Le modèle de souris KI DOP-eGFP révèle que le marquage de DOP est principalement observé dans les cellules NF200-positives, un marqueur des neurones myélinisés du DRG. Le séquençage de l’ARN unicellulaire confirme également que les transcrits d’Orpd1 sont uniquement présents dans les neurones DRG NF200-positifs (Usoskin et al., 2015). De plus, la plupart des cellules DOP-eGFP-positives expriment également TRPV2, un canal présent dans les neurones myélinisés. Comme la plupart des neurones somatosensoriels myélinisés sont mécanosensibles, cette distribution suggère que la DOP joue un rôle dans la douleur mécanique. À l’appui de cette hypothèse, un niveau significatif de marquage de la DOP est trouvé dans les fibres A mécanosensibles à haut seuil (A HTMRs). De manière intéressante, la DOP-eGFP est également co-exprimée avec Ret et/ou TrkC, marqueurs des fibres A mécanosensibles à bas seuil (A LTMRs ; François et Scherrer, 2018). Bien qu’en faible proportion, il est intéressant de noter que la DOP-eGFP est également présente dans les neurones non myélinisés du DRG. Ces neurones ont été principalement identifiés comme de petits neurones non myélinisés exprimant IB4 et P2X3, marqueurs des nocicepteurs C non peptidergiques. Seuls quelques neurones DOP-eGFP-positifs, s’il y en a, ont été identifiés comme étant SP-, CGRP- et TRPV1-positifs, confirmant que la DOP est rarement présente dans les petits neurones peptidergiques du DRG. En utilisant un anticorps dirigé contre le MOP, les études immunohistochimiques ont révélé que chez les souris DOP-eGFP KI, le DOP et le MOP étaient rarement co-exprimés dans les mêmes neurones DRG (moins de 5% de co-expression) mais plutôt séparés dans des populations distinctes, ce qui suggère que ces récepteurs pourraient jouer des rôles différents dans la modulation de la douleur. En effet, il a été démontré que le DOP est principalement impliqué dans le contrôle de la douleur mécanique alors que le MOP contrôle la douleur thermique.
La deuxième école de pensée favorise plutôt l’idée que la distribution de la DOP inclut les petits neurones du DRG et que la DOP et la MOP sont co-exprimées dans certains neurones. Les techniques d’immunohistochimie, de RT-PCR et de PCR unicellulaire ont montré que les neurones DRG positifs pour le DOP étaient souvent de petit diamètre, un tiers de ces neurones co-exprimant également le SP ou le CGRP. De plus, certaines études ont suggéré que le DOP est présent à la fois dans les petits et les grands neurones du DRG. En effet, les approches de RT-PCR, d’hybridation in situ et d’immunohistochimie ont révélé que la DOP est localisée de manière presque égale dans tous les types de neurones. La présence de la DOP sur les neurones somatosensoriels peptidergiques et non peptidergiques myélinisés et non myélinisés soutient un rôle dans le contrôle de la douleur thermique et mécanique. Dans des modèles animaux, il a en effet été démontré que l’activation sélective de la DOP atténuait la douleur mécanique et thermique. Parmi ces résultats, notre groupe a montré, en utilisant l’électrophysiologie in vivo, que l’activation du DOP spinal avec la deltorphine II conduisait à l’inhibition des contrôles inhibiteurs nocifs diffus (DNIC) activés par des stimuli nocifs thermiques et mécaniques. Nous avons également observé que la DOP et la MOP étaient toutes deux capables d’inhiber la libération de SP induite par des stimuli nocifs thermiques et mécaniques dans la moelle épinière.
Une caractérisation approfondie de la DOP sur les terminaux centraux des afférences primaires a révélé des différences importantes entre les rongeurs et les primates. Par rapport aux rongeurs, non seulement un plus grand nombre de neurones DRG expriment le DOP, mais le récepteur est également exprimé dans une plus grande proportion de neurones de moyen et petit diamètre chez les humains et les primates non humains, ce qui soutient un rôle plus spécialisé du DOP dans le traitement de la douleur chez les espèces supérieures.
Indépendamment de la distribution subcellulaire du DOP dans les nocicepteurs, des études électrophysiologiques ont confirmé que l’activation du DOP réduisait l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs évoqués. Cela suggère que la transmission glutamatergique excitatrice dans la lamina II de la moelle épinière est inhibée par une action présynaptique de la DOP, mettant en évidence un rôle du récepteur dans la modulation de la douleur au niveau présynaptique. Si la distribution du DOP dans les afférences primaires et les neurones de la moelle épinière reste un sujet de débat, son expression dans toutes les structures impliquées dans le traitement de la douleur, ainsi que son expression plus restreinte au sein des structures impliquées dans la modulation de la douleur chez les espèces supérieures, élèvent le DOP parmi les cibles les plus prometteuses pour le développement de nouvelles thérapies contre la douleur.
Trafic de la DOP dans les neurones
Le principal défi dans l’élaboration de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de la douleur, et plus particulièrement de la douleur chronique, est de développer des molécules maximisant l’analgésie tout en minimisant les effets indésirables. Comme ils ne produisent pas les effets indésirables courants associés aux opioïdes utilisés en clinique, c’est exactement là que les agonistes sélectifs de la DOP pourraient être utiles. Cependant, dans des conditions normales, les agonistes de la DOP n’ont que de faibles effets analgésiques dans les modèles animaux de douleur provoquée. Il est maintenant reconnu que le faible pouvoir analgésique des agonistes de la DOP est la conséquence d’un faible niveau d’expression au niveau de la membrane plasmique. En effet, plusieurs études utilisant le marquage immunogold en microscopie électronique, le marquage par photoaffinité de récepteurs endogènes et des techniques de fractionnement subcellulaire biochimique ont montré que la DOP se localise principalement dans les compartiments intracellulaires et les organelles alors que seule une petite partie est associée à la membrane plasmique des neurones. Si l’on espère développer des thérapies contre la douleur ciblant la DOP, il faut décrire des stratégies permettant d’augmenter ses niveaux d’expression au niveau de la membrane plasmique neuronale. Les moyens de contrôler le trafic de la DOP et d’augmenter son expression à la surface des cellules incluent un traitement prolongé à la morphine (ou à d’autres agonistes de la DOP) ou une inflammation induite par l’adjuvant complet de Freund. En effet, suite à de tels traitements, la densité de DOP à la surface des cellules augmente dans la moelle épinière, les DRG, et les neurones gris centraux. A ce jour, les mécanismes impliqués dans ce processus restent peu décrits. Plusieurs partenaires d’interaction de DOP ont été identifiés, dont certains sont impliqués dans le trafic de protéines. Nous passons ici en revue ces partenaires de DOP à la lumière de leur rôle potentiel dans le contrôle du trafic cellulaire de DOP et, par voie de conséquence, de la puissance analgésique des agonistes de DOP. En fonction de leur rôle dans la régulation du trafic de la DOP vers la membrane plasmique, le ciblage de ces protéines pourrait être une stratégie pour développer de nouveaux médicaments capables d’augmenter le pouvoir analgésique des agonistes de la DOP.
Deux grandes voies de trafic sont décrites pour les protéines membranaires, à savoir la voie régulée (ou sécrétoire) et la voie constitutive. De nombreuses preuves soutiennent l’idée que la DOP utilise ces deux voies pour atteindre la membrane plasmique. Après avoir été synthétisées dans le réticulum endoplasmique (RE), les protéines membranaires subissent un contrôle de qualité. Les protéines mal repliées sont dirigées vers les lysosomes pour y être dégradées, tandis que celles qui sont correctement repliées sont acheminées vers l’appareil de Golgi où elles subissent des modifications post-traductionnelles comme la glycosylation. Les protéines matures progressent ensuite vers la membrane plasmique soit par la voie régulée, soit par la voie constitutive. La protéine cofiline, une protéine de séparation de l’actine et un puissant régulateur de la dynamique des filaments d’actine, est impliquée dans le trafic des protéines par la voie constitutive. La cofiline joue un rôle dans l’amélioration ou la répression de la libération des protéines de l’appareil de Golgi vers la surface cellulaire. Sa capacité à se lier et à dépolariser l’actine est cependant inhibée lorsqu’elle est phosphorylée par la LIM-kinase 1, une sérine/thréonine kinase qui possède des domaines LIM et PDZ. Cette kinase peut participer à la réorganisation du cytosquelette en phosphorylant la cofiline. La cofiline et des protéines telles que la chronophine et la LIM kinase interagissent et se colocalisent au niveau membranaire avec la β-arrestine (β-arr), soutenant un rôle de cette dernière dans la régulation de leur activité. Il a récemment été démontré que ces processus étaient impliqués dans le trafic de la DOP vers la membrane plasmique. Dans ce contexte, les stratégies visant à diminuer β-arr1 ou son interaction avec DOP, ainsi que l’inhibition de ROCK ou LIM kinase représentent des moyens d’empêcher l’activation de la cofiline et, par voie de conséquence, d’augmenter les effets médiés par DOP.
Une association entre la DOP et des effecteurs en aval tels que le canal ionique Kir3 a également été décrite. Des tests BRET et de co-immunoprécipitation ont révélé que la DOP s’associe aux sous-unités du canal Kir3 dans les neurones corticaux où ils se co-internalisent également lors de la stimulation avec un agoniste. D’autres régulateurs connus du trafic de la DOP sont les kinases des récepteurs couplés aux protéines G (GRK). Les GRK médient la phosphorylation sur leur queue cytoplasmique de nombreux RCPG, dont le DOP. Lorsqu’il est phosphorylé par les GRK, le DOP favorise le recrutement de la β-arrestine, induisant son accumulation dans les puits recouverts de clathrine et les vésicules endocytiques. L’endocytose de la DOP joue un rôle dans la dérégulation de la DOP en déclenchant son trafic vers la voie de dégradation. Bien qu’observé dans divers modèles cellulaires et dans les neurones natifs, la voie de dégradation n’est pas la seule issue pour le tri de la DOP suite à son internalisation. En effet, le destin des récepteurs internalisés est contrôlé par le complexe de tri endosomal requis pour le transport (escrt). Le complexe escrt distingue les récepteurs ubiquitinés et les guide vers les corps multivésiculaires (MVB) où ils sont adressés aux lysosomes pour être dégradés. Le processus d’ubiquitination est tout à fait essentiel pour l’engagement des récepteurs dans une voie de dégradation donnée. Par exemple, l’ubiquitination du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une étape essentielle vers sa dégradation. Concernant le DOP, les récepteurs ubiquitinés sont ciblés vers les MVBs mais, contrairement à l’EGFR, ni son ubiquitination ni son ciblage vers les MVBs ne sont des étapes nécessaires à sa dégradation dans les lysosomes. Certes, toutes les protéines impliquées dans le processus d’internalisation et le routage de la DOP dans la voie endosomale représentent des cibles potentielles pour modifier (positivement ou négativement) ses fonctions. Par conséquent, les stratégies visant à augmenter la densité de la DOP à la surface des cellules et ses propriétés analgésiques peuvent être dirigées vers ces voies.
D’autres acteurs impliqués dans la régulation du trafic de la DOP sont les protéines de signalisation non canonique et les protéines régulatrices. Tout d’abord, la calmoduline et la periplakine sont des modulateurs agissant comme des bloqueurs de la DOP. La calmoduline, ou protéine modulée par le calcium, est un membre largement distribué et polyvalent de la famille des protéines liant le calcium. À l’état de repos, la calmoduline peut s’associer de manière constitutive à la DOP. Une fois activée, la liaison de la calmoduline à DOP est abolie, permettant au récepteur de se coupler aux protéines G. La protéine de signalisation periplakine, un membre de la famille des plakines qui sert de cytolinkers épidermiques et de composants des complexes d’adhésion cellule-cellule et cellule-matrice (Aho et al., 2004), interagit avec DOP, plus spécifiquement avec sa queue cytoplasmique. L’interaction a été confirmée à l’aide d’un système bi-hybride en levure, et le site a été profilé au niveau des résidus 321-331, selon l’analogie avec les récepteurs MOP. Comme pour la calmoduline, la periplakine semble bloquer l’activation de la protéine G en entrant en compétition avec son site d’interaction sur le DOP. On peut affirmer que tout composé capable de bloquer sélectivement l’interaction entre la DOP et ces protéines pourrait augmenter les effets médiés par la DOP.
RGS4 est encore un autre régulateur du trafic de la DOP. RGS4 interagit avec les 26 premiers acides aminés de la queue C-terminale de DOP. Les tests de co-immunoprécipitation entre DOP et RGS4 montrent que la stimulation agoniste ne modifie pas l’interaction, ce qui suggère qu’ils sont constitutivement associés. Cependant, la distribution de RGS4 est déplacée du cytosol vers la membrane lors de l’activation de la DOP. Une autre protéine appelée spinophiline se lie à la même région C-terminale et à la troisième boucle intracellulaire (ICL3) de DOP. La spinophiline est une protéine multidomaine-échafaudage ubiquitaire qui interagit avec l’actine et la protéine phosphatase-1 (PP1). Avec les sous-unités RGS4, Gα et Gβγ, la spinophiline forme un complexe impliquant des régions spécifiques de la protéine et la queue C-terminale de MOP et DOP. Dans les cellules HEK293, une interaction constitutive entre la spinophiline et la DOP ainsi qu’un état modifié après l’administration d’agonistes ont également été observés. Bien que le rôle exact de chaque association ne soit pas encore complètement décrit, leur modulation a le potentiel de réguler l’activité de la DOP et de ses effecteurs en aval et éventuellement son trafic.
Comme brièvement discuté ci-dessus, l’interaction entre les GRK et la DOP est bien établie. Comme le montrent les études de co-immunoprécipitation, l’association des GRKs avec la DOP augmente après traitement avec un agoniste. Plus spécifiquement, GRK2 est transloqué vers la membrane où il peut phosphoryler la queue C-terminale DOP lors de la stimulation. L’interaction entre les GRK et les Gβγ à la membrane est une étape importante pour la translocation de GRK2 du cytoplasme à la membrane cellulaire. L’association rapide de GRK2/GRK3 au DOP suite à la liaison d’un agoniste est également observée dans les cellules vivantes. La colocalisation de GRK2 et de DOP est détectée dans les endosomes après 15 min de stimulation, suggérant que le complexe transloque vers des vésicules recouvertes de clathrine. Ceci semble être spécifique à GRK2 et DOP puisque la colocalisation n’est pas détectée entre DOP et GRK6 ni entre MOP et GRK2. L’interaction entre DOP et GRK2 nécessite la présence de sous-unités Gβγ.
Des essais de colocalisation et d’interaction directe protéine-protéine ont révélé que le recrutement de βarr1 et βarr2 sur DOP est induit soit par l’activation du récepteur, soit par sa phosphorylation par la protéine kinase C. Les sites d’interaction des deux arrestines sur le DOP sont situés dans la région ICL3 (Leu235-Ile259) et la queue C-terminale du DOP. Ces deux régions se lient à des sites non chevauchants sur βarr1. En effet, un mutant DOP dépourvu des 15 derniers résidus de la queue C-terminale n’a montré qu’une réduction de l’association βarr1. La capacité d’un mutant DOP dépourvu de tous les résidus sérine et thréonine de la queue C-terminale à recruter βarr soutient encore la contribution de régions distinctes.
L’interaction entre βarr2 et DOP peut également se produire indépendamment de la phosphorylation. En effet, tant le DOP de type sauvage qu’un récepteur mutant contenant une substitution de tous les résidus sérine et thréonine C-terminaux restent capables de recruter les βarrs. Au contraire, une augmentation de l’interaction entre DOP et βarr2 peut être observée. βarr2 joue un rôle majeur dans la désensibilisation de DOP tandis que βarr1 et βarr2 contribuent de manière similaire au processus d’internalisation. Le lien entre le destin des récepteurs post-endocytaires et les βarrs a également été décrit. Le DOP dépourvu de sites de phosphorylation dans sa queue C-terminale est préférentiellement dégradé via un mécanisme médié par βarr2. En revanche, une petite partie du récepteur de type sauvage est recyclée vers la membrane cellulaire via. Comme mentionné ci-dessus, interférer avec le recrutement des βarrs représente une stratégie pour augmenter les fonctions de DOP, peut-être par l’inhibition de son internalisation et de sa désensibilisation.
Parmi les protéines interagissant avec la DOP, GASP-1 et la glycoprotéine M6a jouent un rôle crucial dans sa régulation. La protéine de tri 1 associée aux récepteurs couplés aux protéines G (GASP-1) est un membre de la famille des protéines GASP. GASP-1 est le membre le plus étudié de la famille et le seul à interagir avec la DOP. Cette protéine de triage est impliquée dans la livraison des récepteurs aux corps multivésiculaires. La machinerie GASP retient le DOP dans les endosomes, empêchant ainsi son recyclage. Cette machinerie participe également au transport de la DOP internalisée vers les lysosomes, un processus indépendant de l’ubiquitination ou des MVB. La deuxième protéine d’interaction, la glycoprotéine M6a, a été identifiée à l’aide d’une approche de levure à deux hybrides. M6a est un membre de la famille des protéines membranaires protéolipidiques (PLP) et est principalement exprimée dans les neurones. Il interagit avec MOP, affectant son endocytose et son recyclage, ainsi qu’avec d’autres GPCRs, dont DOP. En se co-internalisant avec DOP, M6a augmente significativement sa localisation dans les endosomes de recyclage, soutenant un rôle de cette protéine dans le tri post-endocytaire et le recyclage des récepteurs.
Une étude exhaustive utilisant le criblage bi-hybride en levure sur différentes queues C-terminales de RCPG a identifié quatre protéines différentes supposées être impliquées dans le tri post-endocytique des RCPG. Deux d’entre elles sont impliquées dans la voie de recyclage, l’ezrin-radixin-moesin-binding phosphoprotein 50 (EBP50, également appelé Na+/H+-exchanger regulatory factor-1 ou NHERF-1) et le N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF) ; tandis que les deux autres sont impliquées dans le ciblage des récepteurs vers la dégradation lysosomale, GASP-1 et sorting nexin 1 (SNX1). Bien que le rôle de NSF et de SNX1 dans le trafic de DOP reste à déterminer, le rôle de GASP (discuté ci-dessus) et de NHERF-1 est documenté. NHERF-1 est une protéine d’échafaudage contenant un domaine PDZ qui a de nombreuses fonctions telles que l’assemblage de complexes protéiques et le tri des RCPG internalisés (comme les récepteurs β2-adrénergiques et kappa opioïdes) vers la voie de recyclage. Il existe également des preuves suggérant que la DOP interagit avec NHERF-1. En effet, NHERF-1 et DOP peuvent être co-immunoprécipités à partir d’un extrait de tronc cérébral, un effet accru chez les animaux traités à la morphine. L’upregulation de NHERF-1 dans des cellules transfectées augmente le tri de la DOP par le trafic exocytotique, améliorant son insertion membranaire et son expression fonctionnelle (Bie et al., 2010). Une meilleure connaissance des mécanismes régulant l’association de ces protéines avec la DOP ainsi que leur implication exacte dans le trafic de la DOP pourrait permettre de développer des médicaments visant à améliorer le recyclage de la DOP tout en réduisant sa dégradation.
Plus récemment, nous avons utilisé l’analyse par spectrométrie de masse et identifié de nouveaux partenaires d’interaction avec la DOP dans des cellules HEK293 transfectées. Parmi eux, nous avons trouvé de nombreuses sous-unités du complexe protéique coatomère I (COPI). Ce complexe est impliqué dans le transport des protéines du Golgi vers le RE. L’interaction entre la DOP et le COPI pourrait expliquer pourquoi la DOP est largement retenue au niveau intracellulaire. En utilisant deux sous-unités différentes du complexe COPI, β-COP et β’-COP, nous avons confirmé l’interaction de la DOP avec le complexe COPI. Dans ses différentes boucles intracellulaires et sa queue C-terminale, la DOP possède 13 motifs de liaison COPI putatifs (KxK, RxR, RxK ou KxR). En utilisant la mutagenèse, nous avons découvert que la disruption de deux motifs, à savoir K164-K166 (ICL2) et K250-K252 (ICL3), augmentait significativement l’expression de DOP à la surface par rapport au récepteur de type sauvage. Peu après, une autre étude a décrit un rôle de COPI dans la régulation du transport de la DOP vers la membrane plasmique dans les cellules neuronales. Un motif de liaison COPI conservé (RxR) dans la queue C-terminale de la DOP est en effet requis pour la livraison adéquate de la DOP à la membrane plasmique. Un autre point clé du transport de la DOP vers la surface cellulaire passe par son association avec un homologue de la phosphatase et de la tensine (PTEN). Une étude visualisant le trafic et la localisation de la DOP a impliqué un point de contrôle régulé par PTEN dans la rétention de la DOP dans la culture de cellules neuronales primaires. Après l’inhibition de PTEN, les récepteurs disponibles à la surface sont augmentés, ce qui conduit à une augmentation de l’antinociception médiée par la DOP.
Le dernier partenaire à passer en revue ici est la kinase cycline-dépendante 5 (Cdk5). Cdk5 est un membre de la famille des CDK mais contrairement aux autres CDK, Cdk5 n’est pas impliqué dans la progression du cycle cellulaire. Cette sérine/thréonine kinase est plutôt impliquée dans différents processus comme l’activité neuronale, la migration des neurones et la croissance des neurites. Elle phosphoryle une séquence consensus lorsqu’elle est activée par son activateur neuronal spécifique, la cycline-like p35. Une telle séquence consensus est présente dans la deuxième boucle intracellulaire de DOP (T161PAK164). Il a été démontré précédemment que le résidu thréonine (T161) est phosphorylé par Cdk5 dans les cellules neuronales. Lorsque Cdk5 est inhibée par la roscovitine, un inhibiteur de CDK, ou lorsqu’un mutant T161A de DOP est utilisé, le niveau de DOP à la surface des cellules est significativement diminué. Une étude plus récente a également soutenu un rôle de Cdk5 dans la régulation du trafic de la DOP. En utilisant l’inhibiteur de Cdk5 mentionné ci-dessus ou en bloquant la phosphorylation de la DOP par Cdk5 avec un peptide mimétique, une diminution des effets antinociceptifs et anti-hyperalgésiques de l’agoniste sélectif de la DOP, la Deltorphine II, est également observée, ce qui soutient une densité plus faible de DOP à la surface des cellules. Dans l’ensemble, ces observations soutiennent un rôle de Cdk5 dans la promotion de l’expression de la DOP fonctionnelle à la surface cellulaire, peut-être en favorisant sa sortie du RE-Golgi.
Conclusion
La DOP représente une cible prometteuse pour le traitement de la douleur. Comme discuté dans cet article de synthèse, l’expression du DOP est fortement régulée par divers mécanismes. En plus de revoir sa distribution le long des voies de la douleur, nous avons discuté de la manière dont l’expression et le trafic cellulaire de ce récepteur pouvaient être régulés. Nous nous sommes concentrés sur les mécanismes et les partenaires protéiques potentiellement impliqués dans sa rétention intracellulaire ou son trafic vers la surface cellulaire. Ce qui ressort de cet article de synthèse est la complexité entourant la régulation du trafic et des fonctions du DOP. A ce jour, force est de constater que les mécanismes impliqués dans le trafic de la DOP, tant dans des conditions normales que pathologiques, restent mal décrits. Une meilleure compréhension de la distribution de la DOP et de la façon dont différentes protéines peuvent affecter sa signalisation et son trafic vers la surface cellulaire facilitera le développement de meilleures thérapeutiques contre la douleur, peut-être moins nocives.
